ࡱ>  Oh+'0 , H T `lt|%UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAISft NIV BioquimicaEioq Normal.dotEJack Jimerson P. Tadim 4ckMicrosoft Word 8.0d@.W#@kr@v恴CYMicrosoft Office0Modelos50HA<@ ՜.+,D՜.+,T hp  UFMG-CB-m  %UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS Ttulo 6> _PID_GUIDAN{EC43B380-56AE-11BD-BD11-080000369814}50HA<@UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA E IMUNOLOGIA PROJETO DE PESQUISA: ESTUDO INTEGRADO DOS COMPONENTES DO VENENO DE ARANHAS DO GNERO LYCOSA MAIO, 2000- Tpicos de Pesquisa: Caracterizao das espcies coletadas; Biblioteca genmica de um veneno selecionado de uma das espcies; Rastreamento de atividades biolgicas em canais inicos; Atividade inseticida; Atividade txica para camundongos; Purificao de componentes ativos; Estudo do modo de ao dos componentes ativos; Pesquisa de atividade proteoltica do veneno. Equipe: - Prof. Dr. Carlos Ribeiro Diniz.(Prof. Emrito UFMG; Centro de Pesquisa e Desenvolvimento, Fundao Ezequiel Dias, Belo Horizonte MG). - Prof. Dr. Carlos Salas Bravo (Depto.Bioqumica e Imunologia, ICB UFMG); - Profa. Dra. Glria Regina Franco (Depto.Bioqumica e Imunologia, ICB UFMG); - Prof. Dr. Jader dos Santos Cruz (Depto.Bioqumica e Imunologia, ICB UFMG); - Prof. Dr. Marcelo Matos Santoro (Depto.Bioqumica e Imunologia, ICB UFMG); - Prof. Dr. Marcelo Porto Bemquerer (Depto.Bioqumica e Imunologia, ICB UFMG); - Profa. Dra. Maria Elena de Lima Perez Garcia (Depto.Bioqumica e Imunologia, ICB UFMG); - Prof. Mrio de Maria (Depto. de Zoologia, ICB- UFMG) - Prof. Dr. Paulo Srgio Lacerda Beiro (Depto.Bioqumica e Imunologia, ICB UFMG); INTRODUO Propriedades bioqumicas e farmacolgicas de toxinas de aranha As toxinas constituem uma classe bastante diversa de biomolculas, que tm sido muito investigadas devido importncia biolgica em defesa e predao. Entre as toxinas de natureza peptdica ou protica, muitas atuam sobre canais inicos (Darbon et al., 1999; Oliveira, 1997; Possani et al., 1999), outras podem atuar como enzimas proteolticas (Hati et al., 1999) ou como antibiticos (Andreu, 1998; Batista et al., 1999; Yan & Adams, 1998). Outras toxinas continuam sendo investigadas, pois o mecanismo de ao ainda no foi esclarecido (Walker et al., 1999). As toxinas que atuam sobre canais inicos so bastante interessantes, uma vez que muitas delas apresentam seletividade elevada para tipos e sub-tipos de canais. Oliveira et al. (Oliveira, 1997; Walker et al., 1999) tm investigado toxinas do veneno de moluscos do gnero Conus e j encontraram uma diversidade de peptdeos com ao farmacolgica altamente seletiva. Toxinas de outros organismos, como escorpies, aranhas e anfbios (Andreu, 1998; Darbon et al., 1999) tambm podem atuar sobre canais inicos e tm despertado grande interesse de grupos de pesquisa. De acordo com Grishin (1999), mais de 40.000 espcies de aranhas so conhecidas, das quais apenas um pequeno nmero foi investigado quanto composio e s propriedades dos venenos. Os mesmos so constitudos de uma grande variedade de toxinas proticas e peptdicas (Schulz, 1997), muitas das quais possuem pontes dissulfeto mltiplas, de 3 a 7 (Grishin, 1999; Sabatier, 1999). O gnero Lycosa representado por aranhas popularmente conhecidas como aranhas-lobo ou aranhas de jardim, que tem hbitos predatrios. Os componentes do veneno de aranhas do gnero Lycosa continuam pouco estudados. O veneno da Lycosa erythrognatha foi primeiramente estudado por Diniz (1963) que mostrou que o mesmo tem baixa toxicidade, contm histamina, serotonina e polipeptdeos capazes de contrair o leo de cobaia. Cruz et al. (1994) mostraram pela primeira vez que o veneno da Lycosa erythrognatha contm uma frao neurotxica com efeito semelhante ao das toxinas alfa de escorpio, isto o de inibir a inativao dos canais de sdio dependentes de voltagem. Segundo Lucas (1988) a picada por esta aranha causa dor local transitria e no necessita de medicao. O aparecimento de edema e de eritrema so descritos. Os casos relatados no Instituto Butantan (Lucas, 1988) no apresentaram necrose. Segundo Lucas (1988) o nmero de espcies descritas alto e a sistemtica do gnero na Amrica do Sul necessita de reviso. A partir do veneno de outra espcie (Lycosa carolinensis), Yan & Adams (1998) isolaram peptdeos de cerca de 30 resduos, os quais mostraram ao antibacteriana e so capazes de promover a liberao de clcio de sinaptosomas. Esta no uma descoberta surpreendente uma vez que existe uma grande semelhana estrutural entre algumas toxinas e uma classe de peptdeos antimicrobianos (Dimarcq et al., 1999). A investigao de componentes bioativos de venenos animais uma rea de plena atividade cientfica. Podemos citar como exemplo a investigao de Marvin et al. (1999) . Estes autores isolaram, seqenciaram e estudaram a estrutura secundria de uma toxina da aranha Scodra griseipes. Foi a primeira toxina isolada do veneno desta espcie, a qual se mostrou uma inibidora de canais de potssio. Considerando-se a biodiversidade de animais venenosos, novas toxinas podem ser descobertas, as quais podem atuar nos sistemas imune, nervoso ou circulatrio ou ainda atuar como antibiticos. Propomo-nos a investigar os componentes da Lycosa erithroghnata, uma vez que seu veneno ainda pouco investigado e esta uma espcie amplamente distribuda. Gentica molecular das toxinas de aranha Em adio aos estudos bioqumicos e farmacolgicos das toxinas de aranhas, que incluem a elucidao de sua seqncia primria, tipo de atividade e especificidade, recentemente foi iniciada a gentica molecular dessas toxinas com o objetivo de conhecer a estrutura dos genes que as codificam, assim como de determinar a seqncia completa de muitas delas. Estes estudos devem levar a um maior entendimento da relao estrutura/funo das toxinas de aranha. Para isto, foram construdas bibliotecas de cDNA a partir de RNA mensageiro obtido de glndulas de veneno de aranhas. Clones de cDNA codificadores de uma variedade de toxinas foram isolados e seqenciados, revelando informaes significativas sobre a possvel estrutura dessas protenas. Como exemplo temos os clones de cDNA selecionados de biblioteca do veneno da aranha viva negra Latrodectus mactans tredecimguttatus codificadores da a-latrotoxina, ou a-LTx (uma toxina seletiva para vertebrados, que age em terminais pr-sinapticos induzindo a liberao em massa de neurotransmissores), da subunidade b da a-LTx (uma protena de baixo peso molecular, que co-purificada com a a-LTx e semelhante a uma neurotoxina ps-sinaptica da serpente marinha Laticauda semifasciata), da a-latroinsectotoxina, ou a-LIT (uma toxina ativa em insetos, que possui um domnio contendo repeties do tipo anquirina, que pode ser responsvel pela ligao dessa toxina a receptores pr-sinapticos) e da d-latroinsectotoxina, ou d-LIT, a qual tambm ativa em insetos (Kiyatkin et al., 1990, 1992, 1993; Dulubova et al., 1996). Tambm como exemplo temos a clonagem, seqenciamento e caracterizao de precursores de um peptdeo bloqueador de canal de clcio do veneno da aranha Agelenopsis aperta w-Aga IA (Santos et al., 1992) e dos peptdeos ativos em insetos da aranha Plectreurys tristis PltVI e PltXI (Leisy et al., 1996). Estudos moleculares dos genes codificadores de toxinas da aranha armadeira Phoneutria nigriventer tem sido realizados por integrantes deste grupo de pesquisa na UFMG e por outros pesquisadores. A toxina Tx1 foi a primeira a ser clonada e seqenciada por Diniz e colaboradores (1993). A anlise da seqncia do clone demonstrou que Tx1 sintetizada como uma pr-protoxina contendo um peptdeo sinal N-terminal, um peptdeo intermedirio rico em glutamato, seguido da seqncia codificadora de Tx1 e dois resduos de glicina na extremidade C-terminal. A toxina funcional no contm o peptdeo sinal, o peptdeo intermedirio e as duas glicinas terminais, que so removidos durante o processamento do precursor forma ativa. Mais recentemente, foi construda uma biblioteca de cDNA da glndula de veneno dessa aranha com o intuito de isolar clones codificadores de peptdeos neurotxicos. Foram isolados com sucesso desta biblioteca, aps seleo de clones ao acaso, os cDNAs codificadores de Tx2-1 (toxina ativa em mamferos, agindo em canais de sdio) e duas novas isoformas de Tx2-1 e Tx2-5: as Pn2-1A e Pn2-5A (Kalapothakis et al., 1998a), o cDNA da toxina Tx3-2 (bloqueia canais de clcio) e uma isoforma desta, a Pn3A (Kalapothakis et al., 1998b), o cDNA de Tx3-1 (bloqueia canais de potssio) (Kushmerick et al., 1999), o cDNA da toxina Tx4(6-1) (com atividade neurotxica em insetos) e suas isoformas Pn4A e Pn4B (Penaforte et al., 1999) e, finalmente, os cDNAs das toxinas Tx2-6 e Tx2-9 (Penaforte et al., 2000). Todas estas toxinas so produzidas como precursores que contm o peptdeo sinal, o peptdeo intermedirio e, no caso de Tx2-1, Tx3-1 e Tx3-2, tambm um aminocido ou um peptdeo terminal que so clivados e no esto presentes na toxina madura (Penaforte et al., 2000). O veneno das aranhas tem sido fonte de produtos naturais com diversas atividades biolgicas. A maioria conhecida dos peptdeos txicos do veneno so neurotoxinas. Estas molculas podem ser consideradas neurosondas naturais, podendo fornecer informaes importantes nos campos da farmacologia, bioqumica e eletrofisiologia. Alm disso, neurotoxinas podem vir a ser importantes modelos para a indstria farmacutica, agricultura e sade pblica. Entretanto, a utilizao dessas neurotoxinas nativas para estudos muitas vezes invivel j que a separao do veneno em seus componentes txicos isolados um processo rduo e dispendioso. As alternativas so a obteno por sntese qumica ou por clonagem e expresso (Sabatirer, 1999). Assim, a clonagem de toxinas aparece como uma etapa fundamental deste trabalho, pois possibilitar, no futuro, a expresso de grandes quantidades do produto recombinante em um sistema heterlogo (em procariotos, por exemplo), alm de permitir estudos sobre a estrutura e funo dessas protenas. Em Lycosa sp. os estudos de gentica molecular dos componentes peptdicos do veneno ainda no foram iniciados e muito pouco se sabe sobre as substncias bioativas (neurotoxinas, enzimas processadoras, etc) presentes neste veneno. Com o objetivo de caracterizar, de forma geral, os genes expressos na glndula de veneno da aranha ser construda uma biblioteca de cDNA desta glndula. Clones podero ser obtidos aps seleo aleatria e utilizados para a produo de Etiquetas de Seqncias Transcritas (ESTs) por seqenciamento em passo nico em seqenciador automtico de DNA. Esta tcnica foi descrita por Adams e colaboradores (1991) para o estudo de cDNAs de crebro humano e tem sido usada extensivamente em nosso departamento em um projeto de descoberta gnica no parasita Schistosoma mansoni (Franco et al., 1995, 1997, 2000). A tcnica se baseia no seqenciamento apenas das extremidades de cDNAs obtidos por seleo ao acaso de uma biblioteca. Estas seqncias, ou etiquetas dos cDNAs, possuem em torno de 500 nt e so teis para pesquisas de homologia em bancos de dados com seqncias de DNA ou protena. Se houver homologia entre a seqncia submetida pesquisa e as depositadas nos bancos de dados, possvel sugerir uma provvel identificao para o gene em questo. Desta forma, pretendemos uma caracterizao geral dos transcritos expressos na glndula de veneno da Lycosa, com especial ateno para aqueles que codificam provveis toxinas presentes neste veneno. Desde que sejam isolados cDNAs de interesse, estes podem, posteriormente, ser completamente seqenciados e at expressos em um sistema heterlogo de expresso de protenas recombinantes. Em vista da conservao de seqncias das toxinas de aranhas tambm ser possvel a utilizao de sondas de toxinas de outros gneros de aranhas para a triagem desta biblioteca na tentativa de se isolar genes homlogos em Lycosa. JUSTIFICATIVA O gnero Lycosa, embora no seja considerado potencialmente perigoso para a espcie humana, tem alta frequncia de casos de acidentes relatados na literatura, com descrio principalmente de dor no local da picada (Lucas, 1988). Este veneno pouco estudado e o conhecimento de seus componentes, farmacologicamente ativos, pode ser interessante para a revelao de novos frmacos ou mesmo de molculas que sirvam como sondas para estudos bioqumicos envolvendo estrutura e funo de novos polipeptdeos. A nossa proposta a de investigar extensivamente os componentes do veneno da aranha Lycosa, reunindo competncias de diversos pesquisadores de nosso departamento, do Departamento de Zoologia, da Funed e de outras eventuais colaboraes externas. O estabelecimento deste grupo dever, sobretudo, permitir a reunio de competncias e das condies, criando-se um ncleo, para o estudo sistemtico de outros venenos de interesse de nossa, e de outras regies do pas. O grupo pretende com isto se consolidar e buscar resolver outros desafios envolvendo produtos naturais, especialmente venenos, dos quais nosso pas um detentor natural e cujos estudos necessitam de investimento de forma integrada e contnua. OBJETIVOS ESPECFICOS 1. Caracterizao bioqumica dos venenos de Lycosa, com vistas contribuir para a classificao dos espcimens coletados na regio de Santa Brbara e de Belo Horizonte. 2. Isolamento dos componentes peptdicos e proticos do veneno da aranha Lycosa sp. atravs da utilizao de tcnicas cromatogrficas tais como filtrao molecular, troca inica, interao hidrofbica e fase reversa. 3. Caracterizao dos compostos isolados, por anlise de aminocidos, espectrometria de massas e seqenciamento N-terminal. 4. Investigao da atividade dos componentes da toxina sobre canais inicos, como canal de sdio, de potssio ou de clcio. 5. Investigao de possveis componentes com atividade proteoltica,atravs de ensaios de hidrlise de substratos naturais proticos ou de substratos sintticos cromognicos ou fluorognicos. 6. Estudo da importncia da atuao de enzimas proteolticas eventualmente presentes no veneno, no processamento de componentes sintetizados como pr-pro-peptdeos. 7. Verificao da possvel ao inseticida do veneno e de seus componentes isolados. 8. Verificao de ao txica em mamfero (camundongos) do veneno e de seus componentes isolados. Construo de uma biblioteca de cDNA a partir do mRNA das glndulas venenferas. Sequenciamento em um nico passo das extremidades de cDNAs obtidos aleatoreamente da biblioteca para a gerao das ESTs. Utilizao das ESTs para pesquisas de homologia em bancos de dados de sequncias de DNA e protenas. Produo das toxinas que se mostrarem mais promissoras quanto atividade biolgica pela tcnica de clonagem e expresso de seu gene, ou por sntese qumica em fase slida. MATERIAIS E MTODOS 1. Coletas dos animais As aranhas sero coletadas nos arredores de Belo Horizonte e de Santa Brbara e mantidas em criatrio no Laboratrio de Zoologia do Prof. Mrio de Maria. Este trabalho ter a participao de alunos graduandos do curso de Biologia. 2. Extrao do veneno Ser feita uma vez por ms, utilizando-se um estimulador eltrico (choque de ....volts?). O veneno ser coletado com o auxlio de um tubo capilar, congelado e armazenado. Posteriormente ser liofilizado. 3. Perfil cromatogrfico e eletrofortico dos venenos de diversas espcies As amostras de venenos extrados de aranhas cujas caractersticas morfolgicas sugiram diferentes espcies ou sub-espcies, sero submetidas cromatografias (fase reversa ou filtrao molecular), de modo que os perfis obtidos pelo mtodo escolhido possam ser comparados quanto suas composies, viabilisando-se dados complementares para o agrupamento ou no de espcies, ou sub-espcies. O perfil eletrofortico (gel de poliacrilamida 10%) servir ao mesmo objetivo. 4. Purificao de componentes peptdicos e proticos do veneno Os componentes peptdicos do veneno sero isolados atravs de uma combinao de tcnicas cromatogrficas (Janson & Rydn,1998.). Inicialmente, fracionaremos o veneno por cromatografia de filtrao molecular. Os componentes de maior peso molecular sero submetidos a outros processos cromatogrficos, tais como troca inica e interao hidrofbica. Os componentes peptdicos sero purificados por cromatografia de fase reversa. 5. Caracterizao dos componentes peptdicos e proticos do veneno As protenas e os peptdeos isolados dos venenos sero caracterizados por seqenciamento N-terminal, anlise de aminocidos e determinao de massa molecular por espectrometria de massas. As seqncias obtidas sero comparadas com outras seqncias j depositadas em bancos de dados. As purezas sero avaliadas por cromatografia de fase reversa, eletroforese em gel e eletreforese capilar. Quando possvel, determinar o contedo de estrutura secundaria atravs de Dicroismo Circular. 6. Ensaios de atividade proteoltica Ensaios de atividade endopeptidsica sero feitos de acordo com Sarath et al. (1989). Os diferentes ensaios podero detectar diferentes atividades proteolticas: a} atividade tipo Tripsina b) atividade tipo Quimotripsina c) atividade sobre substrato proteico (hemoglobina e/ou casena) d) atividade tipo Gelatinase: eletroforese em gel de poliacrilamida - SDS com substrato protico (gelatina) copolimerizado (Heussen e Dowdle, 1980). 7. Teste da atividade inseticida O veneno total, bem como as fraes obtidas pelo fracionamento do mesmo (dissolvidos em salina contendo albumina bovina, 0,1%) sero testados inicialmente pela injeo intratorcica em mosca domstica (Musca domestica) utilisando-se de uma seringa Hamilton com adaptao de agulha de vidro, conforme descrito por De Lima et al. (1986). 8. Testes da atividade txica em camundongos Injees intra-crebro ventricular do veneno e de suas respectivas fraes solubilizados em salina contendo 0,1% de albumina permitiro avaliar a toxicidade destes componentes para o camundongo. 9. Construo da biblioteca de cDNA As aranhas sero sacrificadas dois dias aps a extrao do veneno e suas glndulas venenferas sero separadas por dissecao e congeladas at o momento do uso. O RNA total ser extrado pelo mtodo do tiocianato de guanidina (Chomczynski & Sacchi 1987). A qualidade do RNA total ser avaliada por eletroforese em gel de agarose/formaldedo. O mRNA ser isolado utilizando o kit Poly (A) Quick mRNA Isolation Kit (Stratagene) e ser quantificado por leitura espectrofotomtrica a 260 e 280 nm. O cDNA ser produzido utilizando o kit  Zap cDNA Synthesis Kit (Stratagene) e ligado nos braos do vetor l Zap. O empacotamento da biblioteca ser feito utilizando-se o kit  Gigapack II Packing Extracts (Stratagene) e a biblioteca ser titulada em bactrias E. coli XL1 Blue. Posteriormente a biblioteca ser amplificada e alquotas das bibliotecas no amplificada e amplificada sero congeladas. Parte da biblioteca ser utilizada para a exciso in vivo em massa do fagemdeo pBlueScript do vetor lZap, utilizando instrues do manual  Zap-cDNA Synthesis Kit . 9. Sequenciamento dos cDNAs e obteno das ESTs Aps exciso in vivo dos fagemdeos pBlueScript carregando os insertos de cDNA, colnias brancas de bactrias recombinantes sero selecionadas das placas de cultura e crescidas em meio lquido contendo ampicilina. O DNA fagemidiano ser extrado das bactrias usando o kit SV Plus Mini Prep Kit (Promega). O seqenciamento cclico do DNA, segundo mtodo de Sanger (Sanger et al., 1977) ser realizado usando o kit Thermo Sequenase (Amersham) e os iniciadores fluorescentes M13 R e M13 universal que se anelam no vetor, na regio adjacente ao stio de clonagem do cDNA. Os produtos do sequenciamento sero submetidos eletroforese em gel de poliacrilamida contendo 8M de uria, no aparelho de sequenciamento automtico de DNA L.F (Pharmacia). Aps a corrida eletrofortica, a sequncia ser editada para remoo de regies de vetor no incio e final da sequncia, para retirada de regies de baixa qualidade de sequncia e para a resoluo de possveis ambiguidades. As ESTs obtidas aps a edio da sequncia devem conter, pelo menos, 150 nt e no mais que 4% de ambiguidades. 10. Pesquisas de homologia em bancos de dados As ESTs sero submetidas pesquisa de homologia utilizando os programas BLASTN e BLASTX (Altschul et al., 1990) no stio do NCBI, NIH (http:\\www.ncbi.nlm.nih.gov). A pesquisa ser feita em bancos de dados no redundantes de DNA e protenas e tambm no banco de dados de ESTs (dbEST). Aps a pesquisa, as ESTs sero classificadas em categorias de acordo com sua possvel identificao baseada em sequncias de genes de outros organismos, ou sero classificadas como desconhecidas se no apresentarem quaisquer homologias com sequncias depositadas em bancos de dados. 11. Produo e purificao das toxinas recombinantes em bactrias Os cDNAs codificadores de toxinas de interesse neste projeto sero posteriormente clonados no vetor pMAL-c2 (New England Biolabs) em continuidade ao gene MalE que codifica a protena ligadora de maltose (MBP). Para isto, sero desenhados iniciadores especficos para a amplificao por PCR do cDNA de interesse, nos quais sero incorporados stios para enzimas de restrio presentes no stio mltiplo de clonagem do vetor. Aps a clonagem, a protena de fuso MBP/protena de interesse ser expressa por induo das bactrias com IPTG e o extrato bruto de bactrias ser obtido por lise das clulas. A purificao da protena de fuso ser feita por cromatografia de afinidade do extrato bruto de bactrias em coluna de amilose, com eluio da protena de fuso com maltose. Para remoo da fuso, a protena MBP/protena de interesse ser tratada com a protease fator Xa e novamente submetida cromatografia. A MBP ficar retida na coluna, enquanto que a protena de interesse no se ligar coluna. Posteriormente a protena ser liofilizada e estocada. ORAMENTO Material de consumo importado: Reagentes (sais, tampes, reagentes para HPLC e FPLC).................... US$ 5000,00 Plsticos e vidraria. ....................................................................................US$ 2000,00 Seringas Hamilton (25 e 50 ml). .................................................................US$ 2000,00 Pipetas automticas (4)..............................................................................US$ 2000,00 Material de consumo nacional Caixas plsticas para a criao de insetos. ....................................................R$ 200,00 Recipientes plsticos para criao de aranhas.............................................. R$ 200,00 Luvas descartveis (20 caixas com 100).........................................................R$ 300,00 Servios de terceiros Aquisio e captura de animais (aranhas). ...................................................R$ 2000,00 Extrao do veneno (servio tcnico). ..........................................................R$ 1000,00 Material permanente importado Um cromatgrafo lquido de alta performance (HPLC) contendo duas bombas com capacidade de fluxo de 10 mL/min acoplado a um detector UV-visvel e a um injetor manual tipo Rheodyne. Computador e programas de anlise e aquisio de dados. Custo estimado (propostas em anexo).....................................................US$ 35.000,00 Um coletor de fraes com interface e PC...............................................US$ 10 000,00 Um potencimetro com sensibilidade 0.01 unidades.............................. FUNES DOS MEMBROS DA EQUIPE Prof. Dr. Carlos Ribeiro Diniz.(Prof. Emrito UFMG; Centro de Pesquisa e Desenvolvimento, Fundao Ezequiel Dias, Belo Horizonte MG) Prof. Dr. Carlos Salas Bravo (Depto.Bioqumica e Imunologia, ICB UFMG); Profa. Dra. Glria R. Franco: construo da biblioteca de cDNA de glndulas de veneno, produo das ESTs, clonagem e expresso em bactrias das protenas de interesse. Prof. Dr. Jader dos Santos Cruz (Depto.Bioqumica e Imunologia, ICB UFMG); Prof. Dr. Marcelo Matos Santoro (Depto.Bioqumica e Imunologia, ICB UFMG); Ensaios de atividade proteoltica; Perfil cromatogrfico e eletrofortico dos venenos de diversas espcies; Purificao de componentes peptdicos e proticos do veneno; Caracterizao dos componentes peptdicos e proticos do veneno. Prof. Dr. Marcelo Porto Bemquerer (Depto.Bioqumica e Imunologia, ICB UFMG); Purificao de componentes peptdicos e proticos do veneno; Caracterizao dos componentes peptdicos e proticos do veneno; Sntese qumica de toxinas. Profa. Dra. Maria Elena de Lima Perez Garcia (Depto.Bioqumica e Imunologia, ICB UFMG); Prof. Mrio de Maria (Depto. de Zoologia, ICB- UFMG) Prof. Dr. Paulo Srgio Lacerda Beiro (Depto.Bioqumica e Imunologia, ICB UFMG); REFERNCIAS Andreu, D. 1998. Antimicrobial peptides. Biopolymers. Peptide Science, 47(6). Special Issue. Atkinson, R.K. & Wright, L.G. 1990. A study of the necrotic actions of the venom of the wolf spider, Lycosa godeffroyi, on mouse skin. Compar. Biochem. Physiol C, 95(2), 319. Cruz, J. S.; Cotta, G.; Diniz, C. R. and Beiro, P. S. L. Partial purification and pharmacological characterization of a neurotoxic fraction isolated from the venom of the spider Lycosa erythrognatha. Braz. J. Med. Biol. Res., 27, 2653-2659. Diniz, C. R. 1963. Separao de protenas e caracterizao de substncias ativas em venenos de aranhas do Brasil. Anais da Academia Brasileira de Cincias, 35(2): 283-291. Darbon, H.; Blanc, E. and Sabatier, J-M. 1999. 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Fmnr]dli t  8 m *1)5xOU?J~ .3"6CS!#M¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾ѸѲ 6OJQJ B*OJQJ6CJCJ656CJ(OJQJOJQJ5CJ$OJQJ5CJ5CJ(OJQJ CJ OJQJ5CJOJQJ CJOJQJF%Fnopqr $  $ $ x  %Fnopqr\]bcdlB0 ½zupkfB0|q'\]bcdlB0 i t u 9 $ $ $ 7dh $ dhx$ i t u 9#$M#*,.C6Q6I8;;);;<(==e> ?`??@@@½zsi_  0    8p01 Q R<Y   ^"9#$M#*,.C6Q6I8;;);;<(==e> ?`??$ dh$ $ x$ $ dh  $&PRZ\zP R !!D!v""""""2#X#x##$2$$$$$+(E(((((^)t)))***M----...81?1@1N11112@4F4;6A6C6Q6I888;);U;\;<&<AA CJ(OJQJ5CJ(OJQJ6CJCJ6B*B* 6OJQJOJQJOJQJT?@@@AAAAAAAAABBBBCC$ dh $   $ dh$ & F 7dh $ & F 7dh 7 $ & F dh@AAAAAAAAABBBBCCCEEEGGGxIIIIITJJJJKKKK$M%MSMNN;NTTTTTYYY\\þ7     R  3AACCEEiF}FGGGII:KKKKKLL%MSMN;NO2O3O7O&Q*Q-R4RRRTTTTTTUUVVYY3ZHZ\U\w`x`y`````bbcce1ef#f(h)h*hHhIhi7ikkkkmOJQJnH CJ(OJQJ CJOJQJ6CJCJ5CJOJQJhnHOJQJ5CJ566 5OJQJLCCEEEGGGxIIIIITJJJJKKKK$M%M dh dh x x dhx dh $ dh%MSMNN;NTTTTTYYY\\U\x`y`````qa$ $ 7   \U\x`y`````qabcccKddee1eeff#fugg)h*hHhIhhiij\jGkk0lllmmm mm2n)ooppxqqTrr0s#tt]u#vv9w5xxx=qabcccKddee1eeff#fugg)h*hHhIhhi $ dh dh$dhdh $ x$ xdh iij\jGkk0lllmmm mm2n)ooppxqqTrr0s#t $  $   dh $ dhmmm mKmgmimpm~m n$n&n+nnnnoooypppHqfqgqnqvqxqqqq/r4r5rErHrNrsttttttt9uJuKuQuuvw,w.wxxx'xxxxxxxxx$ޠ<@VX\УԣޣNCJ5OJQJ 56CJ5CJ6CJCJ5CJ(OJQJ 5OJQJS#tt]u#vv9w5xxx>@XN $ dh dhx$ $ dhx $  quaisquer homologias com seq ):perfispc csHeussen C. & Dowdle, E. B. 1980. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal Biochem, 102, 196-202. mmm mKmgmimpm~m n$n&n+nnnnoooypppHqfqgqnqvqxqqqq/r4r5rErHrNrsttttttt9uJuKuQuuvw,w.wxxx'xxxxxxxxx$ޠ<@VX\УԣޣNCJ5OJQJ 56CJ5CJ6CJCJ5CJ(OJQJ 5OJQJT ) mica e Imunologia, ICB  UFMG); gem do cDNA. Os produtos do seq8M de uria, no aparelho de seqa corrida eletrofortica, a seq vetor no incio e final da seq [(@(NormalCJmH>@>Ttulo 1$$@& 5OJQJ@@@Ttulo 2$<@&56OJQJ:@:Ttulo 3$<@&OJQJ>@>Ttulo 4$<@& 5OJQJL@LTtulo 5$$dhx@& 5OJQJ88Ttulo 6 <@&6CJ6A@6Fonte parg. padro,,titulo1dhCJ hC@hRecuo de corpo de texto$dhB*CJOJQJnHFB@FCorpo de texto$dhOJQJFP@"FCorpo de texto 2 dhOJQJ*2@2*Lista 2 6F0@BFCom marcadores$ dhOJQJN6@RNCom marcadores 2$ dh 5OJQJ<E@b<Lista de cont. 2 6xJQ@rJCorpo de texto 3$ dhOJQJ\R@\Recuo de corpo de texto 2$dhOJQJCm            g",4:#B-JRZk`gCm 2  e S %Fnopqr]^cdemC0grs 7!"K"W$& . ..02223v44n5/66*777V88h9i9j9k99999::::d;e;;===t?u??AAAA#BoBBBBCCCDD"EEE F,J-J.J/J_JNNNPPAQdUeUoUUUU]VV;WX    C` $w $w r= q$  2 {  {    {  {       {     $w    {     {      |,    r=            "   {    4     '8       '8  2     E             O     $w  O/  |, |, |, #2  |, |, |, 7 |, 4  |, O/  |, O/   $w   ԭ  [  ԭ  [   ԭ  ԭ  ԭ  [   ԭ  [  ԭ  ԭ  [  ԭ  ԭ  [  ԭ  qr]^cdemC0gr"W$& . ..j9k9?AAAA#BoBBBBCCCD F,J_JNNP]VV[H\I\\\h]i]]]^^__6`k``ffggEm%rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr""""" Am?EHN9?C%Mqai#tN@BDFIJLMO @\xACGKUnknownJack Jimerson P. 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